Połączenie szybkiego mieszania mikroprzepływowego i trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania kinetyki zmian konformacyjnych białek
Jednocząsteczkowy rezonansowy switch energii Förstera (FRET) doskonale nadaje się do badania kinetyki zmian konformacyjnych białek ze względu na wysoką czułość i zdolność do rozpoznawania poszczególnych subpopulacji w układach heterogenicznych. Jednak najpowszechniejsze podejście wykorzystujące dwa fluorofory może monitorować tylko jedną odległość na raz, a użycie trzech fluoroforów do jednoczesnego monitorowania wielu odległości zostało w dużej mierze ograniczone do fluktuacji równowagi. Tutaj pokazujemy, że trójkolorowy jednocząsteczkowy FRET można łączyć z szybkim mieszaniem mikroprzepływowym w celu zbadania zmian konformacyjnych w białku od milisekund do minut. W połączeniu z mieszaniem ręcznym wydłużyliśmy kinetykę do 1 godziny, co odpowiada łącznemu zakresowi 5 rzędów wielkości w czasie.
Zbadaliśmy konwersję monomeru w protomer tworzącej pory toksyny, cytolizyny A (ClyA), jedną z największych znanych przemian konformacyjnych białka. Specyficzne dla miejsca znakowanie ClyA trzema fluoroforami umożliwiło nam jednoczesne śledzenie kinetyki trzech odległości wewnątrzcząsteczkowych i ujawniło wcześniej niewykryty związek pośredni. Połączenie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET z szybkim mieszaniem mikroprzepływowym zapewnia zatem podejście do badania mechanizmów złożonych procesów biomolekularnych z wysoką rozdzielczością czasową.
Identyfikacja 7 000-9 000 białek z linii komórkowych i tkanek za pomocą mikroprzepływu pojedynczego strzału LC-MS/MS
Obecnym trendem w proteomice jest akwizycja danych w „pojedynczym ujęciu” za pomocą LC-MS/MS, ponieważ upraszcza to przepływy pracy i obiecuje lepszą przepustowość i dokładność ilościową niż schematy obejmujące rozległe frakcjonowanie próbek. Jednak podejścia jednokrotne mogą ucierpieć z powodu ograniczonego pokrycia proteomu, gdy są wykonywane przez akwizycję zależną od danych (ssDDA) w systemach nanoprzepływowych LC. W przypadku zastosowań, w których ilości próbek nie są ograniczone, badanie to pokazuje, że wysokie pokrycie proteomem można uzyskać przy użyciu systemu mikroprzepływowego LC-MS/MS obsługującego kolumnę o średnicy wewnętrznej 1 mm × 150 mm, przy natężeniu przepływu 50 μl/min i sprzężonych do spektrometru masowego Orbitrap HF-X.
Wyniki wskazują na identyfikację ~9000 białek z 50 μg strawionego białka z korzeni Arabidopsis , 7500 z mysiej grasicy i 7300 z ludzkich komórek raka piersi w ciągu three godzin analizy w jednym przebiegu. Dynamiczny zakres oznaczania ilościowego białek mierzony metodą iBAQ obejmował 5 rzędów wielkości, a analiza powtórzeń wykazała, że mediana współczynnika zmienności wynosiła poniżej 20%. Podsumowując , badanie to pokazuje, że ssDDA metodą μLC-MS/MS jest solidną metodą kompleksowej i wielkoskalowej analizy proteomu, którą w przyszłości można rozszerzyć o szybszą chromatografię i metody pozyskiwania danych niezależnych od danych.̀.
Description: A Monoclonal antibody against Human WDR77 / MEP50 (clone 3F10). The antibodies are raised in Mouse and are from clone 3F10. This antibody is applicable in WB and IHC-P, E
Description: A Monoclonal antibody against Human WDR66. The antibodies are raised in Mouse and are from clone 2A6F7. This antibody is applicable in WB, FC, E
Description: A Monoclonal antibody against Human WDR5. The antibodies are raised in Mouse and are from clone 7B11. This antibody is applicable in WB, E
Description: A Monoclonal antibody against Human WDR58 (monoclonal) (M01). The antibodies are raised in mouse and are from clone 1F6. This antibody is applicable in WB and IHC, E
Description: A Monoclonal antibody against Human WDR77 (monoclonal) (M01). The antibodies are raised in mouse and are from clone 3F10. This antibody is applicable in WB and IHC, E
Description: A Monoclonal antibody against Human WDR79 (monoclonal) (M04). The antibodies are raised in mouse and are from clone 1F12. This antibody is applicable in WB and IF, E
Description: A Monoclonal antibody against Human WDR42A (monoclonal) (M01A). The antibodies are raised in mouse and are from clone 1A12. This antibody is applicable in WB
Description: A Monoclonal antibody against Human WDR6 (monoclonal) (M01). The antibodies are raised in mouse and are from clone 2D4. This antibody is applicable in WB
Description: A Monoclonal antibody against Human GOK / STIM1 (C-Terminus, clone CDN3H4). The antibodies are raised in Mouse and are from clone CDN3H4. This antibody is applicable in WB and IHC-P, ICC, IP
Immunoterapia raka z użyciem NC410, białka LAIR-2 Fc blokującego interakcję ludzkiego LAIR-kolagen
Kolageny są głównym składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej i są funkcjonalnymi ligandami dla hamującego receptora immunologicznego związanego z leukocytami receptora podobnego do immunoglobuliny (LAIR)-1. LAIR-2 to wydzielane białko, które może działać jako receptor wabikowy, wiążąc kolagen z wyższym powinowactwem niż LAIR-1. Proponujemy, że kolageny promują unikanie odporności poprzez interakcję z LAIR-1 eksprymowanym na komórkach odpornościowych i że LAIR-2 uwalnia supresję immunologiczną za pośrednictwem LAIR-1.
Analiza publicznych zbiorów danych dotyczących ludzi pokazuje, że kolageny, LAIR-1 i LAIR-2 mają unikalne i nakładające się związki z przeżyciem w niektórych nowotworach. Zaprojektowaliśmy dimeryczny LAIR-2 z funkcjonalnym ogonem IgG1 Fc, NC410, i wykazaliśmy, że NC410 zwiększa ekspansję ludzkich komórek T i funkcję efektorową in vivo w mysim modelu choroby ksenogenicznego przeszczep przeciwko gospodarzowi. W humanizowanych mysich modelach nowotworów NC410 zmniejsza wzrost nowotworu zależny od komórek T. Analiza immunohistochemiczna ludzkich guzów wykazała, że NC410 wiąże się z obszarami bogatymi w kolagen, w których zlokalizowane są komórki odpornościowe LAIR-1 + . Nasze odkrycia pokazują, że NC410 może być nową strategią immunoterapii nowotworów w przypadku guzów z wykluczeniem immunologicznym.
Identyfikacja immunologiczna i charakterystyka białka szkieletowego kapsydu kodowanego przez UL26.5 wirusa Herpes Simplex typu 2
Wirus opryszczki pospolitej typu 2 (HSV2), patogen powodujący zmiany opryszczkowe narządów płciowych, ingeruje w układ odpornościowy gospodarza poprzez różne znane i nieznane mechanizmy. Wirus ten był używany do badania składu antygenowego wirusa. Surowicę rekonwalescencyjną od pacjentów zakażonych HSV2 zastosowano do identyfikacji antygenów wirusowych za pomocą elektroforezy białek 2-D i immunoblottingu. Surowica rozpoznawała głównie kilka białek szkieletowych kapsydu kodowanych przez gen UL26.5, głównie ICP35 .
Doniesiono, że białko to działa przejściowo w tworzeniu wirusów, ale nie ulega ekspresji w dojrzałych cząsteczkach wirusa. Dalsze badania immunologiczne sugerowały, że to białko wywołuje u myszy odpowiedzi swoistych przeciwciał i cytotoksycznych limfocytów T (CTL), ale te odpowiedzi nie dają klinicznego efektu ochronnego w odpowiedzi na prowokację HSV2 . Dane sugerują, że immunodominacja ICP35 może być wykorzystana do zaprojektowania zintegrowanego antygenu z innymi glikoproteinami wirusowymi.
Autoimmunologiczne sygnatury starzenia się i chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem są powiązane z funkcją mózgu i białkami rybosomalnymi
Biologiczne starzenie się to złożony proces charakteryzujący się upośledzeniem funkcji komórek i tkanek, w tym układu odpornościowego. W konsekwencji starzenie się wpływa na ekspresję i rozwój autoprzeciwciał oraz autoreaktywnych limfocytów T, co w ich sumie można uznać za autoimmunom osobnika. W tym badaniu przeanalizowaliśmy, czy zestawy cech autoimmunologicznych są powiązane z określonymi fenotypami, które tworzą sygnatury autoimmunologiczne związane z wiekiem i chorobami neurodegeneracyjnymi . Dane profilu autoprzeciwciał zdrowych osobników i pacjentów z bazy danych GEO wykorzystano do zbadania autoimmunologicznych sygnatur starzenia i trzech chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Parkinsona (PD), choroby Alzheimera (AD) i stwardnienia rozsianego (MS).
Nasze wyniki pokazują, że autoimmunomiczną sygnaturę starzenia charakteryzuje falisty wzrost autoprzeciwciał IgG związanych z uczeniem się i zachowaniem oraz stały wzrost autoprzeciwciał IgG związanych z rybosomami i translacją, a autoimmunomiczna sygnatura starzenia jest również związana z neurodegeneracyjną chorobą związaną z wiekiem. choroby. Co ciekawe, Analiza Różnicowej Ekspresji-Sliding Window Evaluation (DE-SWAN) zidentyfikowała trzy fale zmian autoprzeciwciał podczas starzenia się odpowiednio w wieku 30, 50 i 62 lat. Ponadto autoprzeciwciała IgG, w szczególnościte skierowane przeciwko białkom rybosomalnym mogą zostać wykorzystane jako markery prognostyczne dotyczące starzenia się i związanych z wiekiem chorób neurodegeneracyjnych. Dlatego w tym badaniu po raz pierwszy odkryto kompleksowe sygnatury autoimmunologiczne dotyczące starzenia się i związanych z wiekiem chorób neurodegeneracyjnych.
Description: A polyclonal antibody against NUDCD3. Recognizes NUDCD3 from Human. This antibody is HRP conjugated. Tested in the following application: ELISA
Description: A polyclonal antibody against NUDCD3. Recognizes NUDCD3 from Human. This antibody is FITC conjugated. Tested in the following application: ELISA
Description: A polyclonal antibody against NUDCD3. Recognizes NUDCD3 from Human. This antibody is Biotin conjugated. Tested in the following application: ELISA
